来源：生物探索 CRISPR相关转座子（CAST）通过CRISPR系统实现RNA介导的大片段DNA定向移动。整个过程避免了暴露断裂的DNA双链，并且不依赖细胞自身的同源重组修复机制，这使得CAST系统在生物医学研究和遗传病治疗中具有巨大的应用潜力。CAST系统主要来源于Tn7-like转座子家族。 近年来，研究人员对不同类型的CAST系统（如V-K【1】、I-B【2】和I-F【3】）的分子机制有了深入理解【4】。虽然这些系统在招募蛋白质的方式上有很大差异，但它们的核心机制类似：CRISPR模块首先精准识别靶位点，接着核酸酶TnsA和转座酶TnsB识别并切割转座子DNA的末端。在调控蛋白TnsC的帮助下，转座子DNA被准确插入靶位点。CRISPR模块与转座模块通过TniQ蛋白（TnsD同源蛋白）连接，从而实现了RNA介导的转座过程。此前的研究多集中于CRISPR模块如何识别靶点并通过TniQ连接两个功能模块【5-14】。虽然V-K CAST系统完整转座复合体的结构在之前已经被解析【15】，但由于该系统缺少大部分系统中都存在的核酸酶TnsA，无法完全解释TnsA、TnsB和TnsC在转座过程中的合作机制。此外，某些CAST系统（如I-B和I-D【16,17】）保留了Tn7系统中由TnsD介导的DNA整合方式，TnsD如何识别特定DNA序列并招募TnsABC复合物，仍需进一步研究。 2024年10月8日，美国普渡大学畅磊福研究团队在Cell杂志上发表了题为TnsABCD转座体的结构揭示了靶向DNA转座的机制的研究论文【18】。该研究以来自地衣中的蓝细菌共生体Peltigera membranacea cyanobiont 210A 的I-B 型CAST（PmcCAST）为研究模型，通过冷冻电镜（cryo-EM）和生化分析的方法，首次揭示了TnsD如何识别特定的tRNA-Val基因并招募TnsABC蛋白复合体，完成定点的DNA插入。 结合2023年报道的PmcCascade-DNA-TniQ-TnsC复合体的结构模型【14】，团队搭建了完整的PmcCascade-DNA-TniQ-TnsC-TnsAB复合体的结构模型，并对两种DNA整合机制的效率和特异性进行了比较和讨论。团队在Tn7-like转座复合体TnsABCD-DNA和TnsC-TnsD-DNA的分子结构中发现了很多有趣的分子间相互作用。这一研究成果不仅为 CAST系统的开发应用提供了新思路，还进一步加深了对转座机制的理解。 值得一提的是，TnsABCD介导的转座是经典的Tn7-like转座子通路，从Tn7早期研究至今已有30余年历史，而本研究首次解析了该完整复合体的结构。 该研究的主要发现如下 （图1）： （1） 在TnsC-TnsD-DNA复合体和TnsABCD-DNA复合体中，靶标DNA（Target DNA）都呈现出弯曲状态。特别值得注意的是，TnsD中的R445氨基酸残基嵌入CC/GG碱基对之间，进一步影响DNA的形变。当R445突变成丙氨酸后，转座活性显著下降，且在TnsC-TnsDR445A 系列-DNA的冷冻电镜结构中，TnsD的C端识别序列的结构域不再可见。这表明，R445残基嵌入DNA对于识别靶序列和形成稳定的TnsC-TnsD-DNA复合体至关重要。 （2） TnsC通过与TnsB的C端尾部相互作用，招募TnsB参与转座过程。在TnsC的七聚体中，有4个亚基显示出多余的TnsB的C端尾部的密度图。这表明，形成稳定的TnsC七聚体对于有效招募TnsB十分重要。 （3） TnsC的C端尾部位于TnsA、TnsB和DNA的交界处，直接参与了TnsAB-DNA链转移复合物（Strand transfer complex）的组装，且相互作用的氨基酸在I-B型CAST系统中具有保守性。 （4） TnsA的核酸酶结构域与TnsB的RNaseH-like结构通过延伸的β折叠片相互作用。TnsA的DNA底物在–3和–4之间的磷酸二酯键离其活性中心最近。这一结构观察与先前原始Tn7的生化数据显示的TnsA和TnsB切割位点相差3个碱基的结果相一致。 （5） TnsD介导的DNA整合与RNA介导的DNA整合在靶标DNA的识别区域上有所不同，导致插入位点与识别位点之间的距离差异。这两种整合方式效率的不同，可能与TnsC七聚体的稳定性有关。在TnsD介导的整合中，TnsD与TnsC存在两个接触面，且DNA的嵌入可能进一步增强了TnsC在目标DNA上的稳定性。 总之，本研究加深了我们对Tn7-like转座子和CAST系统中DNA靶向插入的结构和机制的理解，为将该系统开发成精准DNA插入工具的研究奠定了基础。 1. Strecker， J.， Ladha， A.， Gardner， Z.， Schmid-Burgk， JL， Makarova， KS， Koonin， EV 和 Zhang， F. （2019）。使用 CRISPR 相关转座酶进行 RNA 引导的 DNA 插入。科学 365， 48-53。10.1126/science.aax9181。 2. Saito， M.， Ladha， A.， Strecker， J.， Faure， G.， Neumann， E.， Altae-Tran， H.， Macrae， RK和Zhang， F.（2021 年）。CRISPR 相关转座子归巢的双模式。单元格 184， 2441-2453 e2418。10.1016/j.cell.2021.03.006. 3. Klompe， SE， Vo， PLH， Halpin-Healy， TS 和 Sternberg， SH （2019）。转座子编码的 CRISPR-Cas 系统直接 RNA 引导的 DNA 整合。自然 571， 219-225。10.1038/s41586-019-1323-z。 4. Hsieh， SC 和 Peters， JE （2024）。具有 CRISPR 相关 Tn7 样转座子的天然和工程向导 RNA 定向转座。Annu Rev Biochem 93， 139-161。10.1146/annurev-biochem-030122-041908。 5. Halpin-Healy， TS， Klompe， SE， Sternberg， SH 和 Fernandez， IS（2020 年）。转座子编码的 CRISPR-Cas 系统靶向 DNA 的结构基础。自然 577， 271-274。10.1038/s41586-019-1849-0。 6. Jia， N.， Xie， W.， de la Cruz， MJ， Eng， ET 和 Patel， DJ （2020）。通过 CRISPR-Cas-转座子复合物整合 DNA 的初始步骤的结构-功能见解。细胞研究 30， 182-184。10.1038/s41422-019-0272-2。 7. 李 Z.、张 H.、肖 R. 和张 L.（2020 年）。与转座蛋白 TniQ 结合的 I 型 CRISPR RNA 引导监测复合物的冷冻电镜结构。细胞研究 30， 179-181。10.1038/s41422-019-0268-y。 8. Petassi， MT、Hsieh， SC 和 Peters， JE （2020）。向导 RNA 分类可在 Tn7-CRISPR-Cas 转座子中选择靶位点。细胞 183， 1757-1771 e1718。10.1016/j.cell.2020.11.005。 9. Wang， B.， Xu， W.， 和 Yang， H. （2020）。Tn7 样转座酶募集和 DNA 加载到 CRISPR-Cas 监视复合物的结构基础。细胞研究 30， 185-187。10.1038/s41422-020-0274-0。 10. Park， JU， Tsai， AW， Mehrotra， E.， Petassi， MT， Hsieh， SC， Ke， A.， Peters， JE 和 Kellogg， EH （2021）。RNA 引导的 DNA 转座系统中靶位点选择的结构基础。科学 373， 768-774。10.1126/science.abi8976 的。 11. Querques， I.， Schmitz， M.， Oberli， S.， Chanez， C.， 和 Jinek， M. （2021）。通过 V 型 CRISPR 转座子系统选择和重塑目标位点。自然 599， 497-502。10.1038/s41586-021-04030-z。 12. Xiao， R.， Wang， S.， Han， R.， Li， Z.， Gabel， C.， Mukherjee， IA， 和 Chang， L. （2021）。CRISPR-Cas12k 识别 RNA 引导的 DNA 转座靶 DNA 的结构基础。分子细胞 81， 4457-4466 e4455。10.1016/j.molcel.2021.07.043. 13. Schmitz， M.， Querques， I.， Oberli， S.， Chanez， C. 和 Jinek， M. （2022）。组装 V 型 CRISPR 相关转座子复合物的结构基础。单元格 185， 4999-5010 e4917。10.1016/j.cell.2022.11.009. 14. Wang， S.， Gabel， C.， Siddique， R.， Klose， T.， 和 Chang， L. （2023）。IB 型 CRISPR 效应子募集 Tn7 样转座子的分子机制。单元格 186， 4204-4215 e4219。10.1016/j.cell.2023.07.010. 15. Park， JU， Tsai， AW， Rizo， AY， Truong， VH， Wellner， TX， Schargel， RD 和 Kellogg， EH （2023）。全息 CRISPR RNA 引导的转座子整合复合物的结构。自然 613， 775-782。10.1038/s41586-022-05573-5。 16. Faure， G.， Saito， M.， Benler， S.， Peng， I.， Wolf， YI， Strecker， J.， Altae-Tran， H.， Neumann， E.， Li， D.， Makarova， KS， et al. （2023）。Tn7 转座子中靶标选择者的模块化和多样性。分子细胞 83， 2122-2136 e2110。10.1016/j.molcel.2023.05.013. 17. Hsieh， SC 和 Peters， JE （2023）。在蓝细菌的不同 Tn7 样元件中鉴定的新型 I-D 型 CRISPR 引导的转座子的发现和表征。核酸研究 51， 765-782。10.1093/nar/gkac1216 的。 18. Wang， S.， Siddique， R.， Hall， MC， Rice， PA 和 Chang， L. （2024）。TnsABCD 转座体的结构揭示了靶向 DNA 转座的机制。细胞。